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      網站首頁  ◇  技術文章  ◇  培養箱中微生物菌種保藏方法
      培養箱中微生物菌種保藏方法
      來源:技術文章    發布時間:2022-06-24    瀏覽:138次
      常用的冷凍保存法包括:  
      ①低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃):低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便,也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多,有些可添加保護劑。此外,也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器內,再放入低溫冰箱內進行保存的。  
      ②干冰保存法(-70℃左右):即將菌種管插入干冰內,再置于冰箱內進行冷凍保存。  
      ③液氮保存法(-196℃):是適用范圍最廣的微生物保存法。其操作步驟如下,a、裝安瓶管:使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中,將0.2~1ml的這種溶液分裝于安瓶中,或在裝有分散劑的安瓶中直接接種,或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。  
      b、熔封安瓶管:若直接貯存于氣相液氮中(-150℃~-170℃)時,則不需熔封。  
      c、檢查安瓶管是否熔封良好:即在4℃下,將熔封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡2~30分鐘后,觀察有無色素進入安瓶。  
      d、緩慢冷卻:將熔封安瓶管置于小罐中,然后用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至-25℃左右,也可在-20℃~-25℃的冰箱內緩慢冷卻30~60min。  
      e、速冷:最后浸入液氮中快速冷卻至-196℃。  
      7、冷凍干燥保存法:其原理是首先將微生物冷凍,然后在減壓下利用升華現象除去水分。事實上,從菌體中除去大部分水分后,細胞的生理活動就會停止,因此可以達到長期維持生命狀態的目的。該方法適用于絕大多數微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。  
      在進行冷凍干燥時,需注意以下幾個問題:  
      a、冷凍干燥前的培養條件:首先檢驗菌種純度。一般地說,將待保存的微生物在營養豐富且容易增菌的培養基上進行培養為宜;菌齡以達到對數生長期為好;若為有芽孢或孢子的微生物,則以芽孢和孢子形成以后進行保存為好;菌液濃度以高為好,如細菌應達到109~1010/ml。  
      b、菌株號碼等的標記:可在安瓶外側標記或在安瓶內封入標簽。  
      c、安瓶的準備:將安瓶在2%HCl中浸泡過夜,自來水沖洗3次后,蒸餾水刷凈,干燥,塞棉塞,貼標簽,干熱滅菌或溫熱滅菌后,60℃恒溫干燥。  
      d、添加保護劑:常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。  
      8、Bordelli氏法:取干凈的小試管(8×60mm)塞上棉塞,滅菌。用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔,制成濃厚菌懸液。然后用無菌吸管將菌懸液滴入小試管底部。每管一滴,然后轉動小試管使菌液分散在試管底部的壁上。標記菌名。將小試管裝在15×150mm的試管中,在大試管底部事先裝上1.5cm高的(P2O5或KOH),管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊,蠟封。將大試管與真空泵連通,抽真空至0.1~0.2mm汞柱時,將玻璃管熔封,置室溫暗處或冰箱保存。  
      儀器與材料1、斜面菌種:絲狀真菌、酵母菌、芽孢桿菌和無芽孢桿菌各一支。  
      2、接種用具一套。  
      3、滅菌物品:1ml、5ml吸管,長滴管,安瓶管,9ml無菌水試管,砂土管,液體石蠟,脫脂牛乳。其中,液體石蠟的處理為1.5kg/cm2壓力滅菌1小時或1kg/cm2壓力滅菌3次,每次30分鐘。接著檢查是否徹底無菌,即接入肉湯中檢查有無雜菌生長。最后放在60~80℃轟烤以去除水分。脫脂牛乳的處理為2000rpm離心10分鐘脫脂,然后0.5kg/cm2壓力滅菌20分鐘,或間歇滅菌3次,經檢查無菌后備用。  
      4、P2O5,無水CaCl2各一瓶。  
      5、真空干燥器,真空泵。  
      方法1、液體石蠟覆蓋法:取待保存的菌種斜面,用5ml無菌吸管向內加入滅菌石蠟,要求液體石蠟高出菌斜面1cm左右,若不夠此高度,則常會引起斜面抽干現象。  
      2、砂土管法:用1ml無菌吸管吸取0.2~0.5ml菌懸液,滴入砂土管中,充分混勻后,將砂土管放入真空干燥器內,抽干,真空干燥器內需放置無水CaCl2。最后,將干燥好的砂土管取出,迅速于火焰上蠟封管口,并在室溫下或冰箱中進行保存。  
      3、冷凍干燥保藏法:  
      ①用滅菌長滴管取出2滴(約0.1ml)無菌脫脂牛乳,置于無菌安瓶管中,然后用另一支無菌滴管取出等體積的濃菌液,同樣置于此安瓶管中,充分混勻。  
      ②集中安瓶管,置于100ml燒杯中,將燒杯裝進真空冷凍干燥器的鐘罩內,開機并開冷卻水后,使菌液在-20℃溫度下迅速凍結成固體,然后抽真空使水分升華,2小時后,可以停止冷凍并在稍高的溫度下進行干燥,直至全干為止。  
      ③最后取出安瓶管,并將其與真空泵連接,再抽真空后,迅速將安瓶管熔封,最后冰箱保存。  
      4、甘油管保藏法:在5ml菌種保藏管中,將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后,于-20℃冰箱中保存。

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